Persona: Cabria Ramos, Juan Carlos
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Publicación Acceso Abierto Protocolo para la identificación rápida y sensible de ricina en muestras ambientales ante una alerta biológica(Sanidad Militar, 2017) Peraile, Inés; Lorenzo Lozano, Paloma; Gil García, Matilde; González López, Laura; Cabria Ramos, Juan Carlos; Jiménez Pérez, M. V.Introducción: La ricina es una toxina muy potente que ha adquirido importancia por su potencial uso como arma biológica, fundamentalmente en forma pulverulenta. El desarrollo de métodos que permitan una detección rápida y temprana tras la exposición a la toxina permitiría reducir las tasas de morbilidad y mortalidad asociadas. Ante una alerta/amenaza biológica con una muestra sospechosa de contener ricina, la Red de Laboratorios de Alerta Biológica (RELAB), infraestructura de naturaleza científico-técnica creada mediante la Orden PRE/305/2009, autoriza el envío de la muestra al Instituto Nacional de Técnica Aerospacial (INTA), uno de los laboratorios de referencia que integran esta Red. Objetivos: Desarrollo de un protocolo para la detección de ricina basado en una doble detección, un ensayo inmunológico y un análisis proteico, para aumentar la fiabilidad del diagnóstico además de acortar sensiblemente el tiempo de respuesta del laboratorio. Material y Métodos: El diagnóstico inmunológico con anticuerpos in house combinados en un ELISA tipo Sandwich. El diagnóstico proteico mediante la técnica SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico) para determinar el tamaño y la estructura de las distintas proteínas de la muestra. Resultados: La optimización del marcado de los anticuerpos de detección así como la preparación y almacenamiento de placas previamente tapizadas/bloqueadas permite conseguir un ensayo muy sensible (<1 ng/mL) en un tiempo inferior a cuatro horas.Publicación Restringido Biofunctionalization of nylon nanofibers to be used in immunobiosensor for biological warfare agents detecting(Formatex Research Center, 2018) Peraile, Inés; Lorenzo Lozano, Paloma; Murillo, N.; Maudes, J.; Rozas Sanz, Gabriel; Pérez Márquez, Ana; González López, Laura; Cabria Ramos, Juan Carlos; Gil García, MatildeThe use of biological warfare agents involves a growing threat to society. Thus, the most countries have been forced to increase resources in research for their detection and identification. One of the critical points in the effective fight against these agents is the development of devices that allow their detection and early identification. The best choice is the immunobiosensors easy to use on-site. However, how the antibody is attached to the biosensor surface, in terms of density and orientation, will determine the diagnosis capability of the device. In this study, both a functional nanofiber able to increase the surface / volume relation, and a chemicallysimilar planar membrane were used as support for the immobilization of antibodies. Different antibody immobilization systems were carried out to biofunctionalize both surfaces: passive adsorption, covalent bond by glutaraldehyde and well-oriented immobilization by protein A/G. Our results showed that nanofibers in combination with protein A/G were a very effective immunocapture system for being used in a biosensor.Publicación Acceso Abierto Spanish Outbreak Isolates Bridge Phylogenies of European and American Bacillus anthracis(MDPI - Multidisciplinary Digital Publishing Institute, 2023-03-29) Bassy Alvarez, Olga; Antwerpen, Markus; Ortega García, María Victoria; Ortega Sánchez, María Jesús; Bouzada, José Antonio; Cabria Ramos, Juan Carlos; Grass, Gregor; Ortega García, María VictoriaThe geographical origin of a major present-day phylogenetic group (A branch WNA; A.Br.WNA) of American Bacillus anthracis is controversial. One hypothesis postulated that the anthrax pathogen reached North America via a then-existing land bridge from northeastern Asia thousands of years ago. A competing hypothesis suggested that B. anthracis was introduced to America a couple of hundred years ago, related to European colonization. The latter view is strongly supported by genomic analysis of a group of French B. anthracis isolates that are phylogenetically closely related to the North American strains of the A branch A.Br.WNA clade. In addition, three West African strains also belong to this relationship group. Recently, we have added a Spanish strain to these close relatives of the WNA lineage of American B. anthracis. Nevertheless, the diversity of Spanish B. anthracis remains largely unexplored, and phylogenetic links to European or American relatives are not well resolved. Here, we genome sequenced and characterized 29 new B. anthracis isolates (yielding 18 unique genotypes) from outbreaks in west central and central Spain in 2021. Applying comparative chromosomal analysis, we placed the chromosomes of these isolates within the established phylogeny of the A.Br.008/009 (A.Br.TEA) canonical SNP group. From this analysis, a new sub-clade, named A.Br.11/ESPc, emerged that constitutes a sister group of American A.Br.WNA.Publicación Acceso Abierto Evaluación de detectores de aerosoles biológicos en túnel de viento(Ministerio de Defensa, 2019-02-15) Dabbagh Escalante, Nushin Alba; Rozas Sánz, Gabriel; Peraile, Inés; González López, Laura; Cabria Ramos, Juan Carlos; Lorenzo Lozano, Paloma"Durante el siglo pasado, los avances en biotecnología y bioquímica han simplificado el desarrollo y la producción de armas biológicas. Estas pueden ser más potentes que las armas convencionales o las armas químicas por su alta contagiosidad, fácil difusión y la cantidad mínima de organismos requeridos para causar enfermedad y/o muerte. Los agentes biológicos que tienen mayor probabilidad de ser utilizados como armas biológicas son bacterias, rickettsias, virus y toxinas, y la vía de dispersión de mayor interés desde el punto de vista de la seguridad y la defensa son los bioaerosoles. Desde los ataques con ántrax producidos en 2001 en EE.UU., los países han incrementado considerablemente los esfuerzos en investigación para el desarrollo de nuevas tecnologías que permitan una detección temprana de las amenazas biológicas. Disponer de sistemas de detección en tiempo real y con una elevada sensibilidad permite minimizar los riesgos de exposición a este tipo de agentes, ya que la información obtenida puede ser utilizada para adoptar medidas de protección y prevención apropiadas a la amenaza detectada. El área de defensa biológica del Departamento de Sistemas de Defensa NBQ y Materiales Energéticos de la Subdirección General de Sistemas Terrestres del INTA (Campus La Marañosa) ha puesto a punto una metodología para evaluar nuevos equipos de detección de aerosoles biológicos. La eficacia de estos equipos se ha analizado en términos de tiempo de respuesta, sensibilidad y capacidad para diferenciar entre eventos biológicos y no biológicos. Los ensayos se han realizado en un túnel de viento (diseñado por la empresa Ibatech) sobre el que se inyectan aerosoles biológicos de concentraciones conocidas. Para la generación de la nube se han utilizado simulantes de agentes de guerra biológica (Bacillus thuringiensis como simulante de Bacillus anthracis y Pantoea agglomerans como simulante de Yersinia pestis)."Publicación Restringido Development of a specific real-time PCR assay for simultaneous detection and differentiation of Coxiella burnetii strains from environmental soil samples(Oxford University Press, 2023-02-25) Fernández Carrillo, Juan; Del Olmo Monge, Javier; Sellek Cano, Ricela, Ricela; Ortega García, María Victoria; Cabria Ramos, Juan Carlos; Bassy Alvarez, OlgaCoxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is a small, coccoid, Gram-negative strict intracellular pathogen. One of the most common ways of acquiring Q fever is through inhalation of aerosols containing the bacteria. Because C. burnetii is highly infectious, spreads easily through the air, and is very resistant to environmental conditions, it is considered a biological threat. This paper presents the development and validation of a specific real-time polymerase chain reaction (real-time PCR or qPCR) assay for the detection of C. burnetii, based on the amplification of a fragment of the isocitrate dehydrogenase (icd) encoding gene. This real-time PCR is highly specific, reproducible, and sensitive, allowing the detection of as few as 5 genome equivalents (GEs) of C. burnetii per reaction. The method enables a rapid preliminary differentiation among strains, based on a point mutation at nucleotide 745 of the icd gene. The assay was successfully evaluated in environmental soil samples; a limit of detection of 3 × 104 colony forming units per 0.5 g of soil (∼3 GEs per reaction) was achieved. The newly developed real-time PCR offers a valuable tool for differential detection of C. burnetii strains in environmental soil samples.Publicación Restringido Recovery of Francisella tularensis from soil samples by filtration and detection by real-time PCR and cELISA(Royal Society of Chemistry, 2008-01-17) Sellek Cano, Ricela; Jiménez, Oscar; Aizpurua, Carmen; Fernández Frutos, Begoña; De León, Patricia; Camacho, Maite; Fernández Moreira, Daniel; Ybarra, Carmen; Cabria Ramos, Juan CarlosThe aim of this study was to develop a specific and highly sensitive method able to detect very low concentrations of Francisella tularensis in soil samples by real-time PCR (qPCR) with SYBR Green I. tul4gene, which encodes the 17-kDa protein (TUL4) in F. tularensis strains, was amplified using a LightCycler (LC) device. We achieved a detection limit of 0.69 fg of genomic DNA from F. tularensis subp. holarctica live vaccine strain (LVS), corresponding to a value less than 3.4 genome equivalents per reaction. The qPCR was shown to be specific, highly sensitive and reproducible. In addition, we evaluated 2 new methods for recovering bacteria from soil based on 1-step filtration using glass fiber filters and PVDF filters. These filtration methods enabled us to recover F. tularensis efficiently from soil samples. As few as 50 CFU per 0.5 g of soil were detected by qPCR. Capture enzyme-linked immunosorbent assay (cELISA) allowed us to detect and quantify the amount of bacteria recovered from soil by an immunological method. Although qPCR was more sensitive than cELISA, we did not observe substantial differences in the amount of bacteria quantified by both methods.Publicación Acceso Abierto Optimización del proceso de inmovilización de anticuerpos en inmunobiosensores(Sanidad Militar, 2018) Peraile, Inés; Gil García, Matilde; Guamán Collaguazo, C. E.; González López, Laura; Cabria Ramos, Juan Carlos; Lorenzo Lozano, PalomaAntecedentes: La detección rápida y específica de agresivos biológicos es fundamental en diversos campos como control ambiental, diagnóstico clínico, industria alimentaria, seguridad y defensa. La especificidad de la unión antígeno-anticuerpo es empleada en multitud de biosensores, como equipos de identificación de agentes de guerra biológicos, pero el cómo se una ese anticuerpo en la superficie del biosensor, en términos de densidad, orientación, y estabilidad determinará la capacidad diagnóstica del dispositivo. Objetivo: Desarrollo de procesos de inmovilización de anticuerpos en superficies planares que permitan una unión antígeno-anticuerpo eficiente, para su posterior uso en dispositivos inmunológicos de sensado. Material y Métodos: Se ensayaron tres métodos de inmovilización del anticuerpo-fluoresceína sobre una membrana Zprobe: adsorción pasiva, unión covalente con glutaraldehído (0,5 %) y unión orientada con proteína mediadora A/G (5 y 10 µg). Se seleccionó albúmina sérica bovina-ficoeritrina como simulante de toxina proteica. Resultados: El porcentaje de retención del anticuerpo inmovilizado durante el proceso de inmunocaptura fue similar en los métodos ensayados. La densidad del anticuerpo inmovilizado fue mayor en la inmovilización con glutaraldehído y menor con proteína A/G. Sin embargo, respecto a la eficiencia de la inmunocaptura del antígeno, la inmovilización del anticuerpo con glutaraldehído fue la menos eficiente frente a la inmovilización con proteínas A/G, que resultó ser la más eficaz. Conclusiones: La utilización de glutaraldehído en la inmovilización del anticuerpo, aunque incrementa la densidad de unión del mismo sobre una membrana Zprobe, interfiere en el proceso de inmunodetección antigénica, mientras que el uso de la proteína mediadora A/G permiten un sistema de inmunocaptura más eficiente, con una menor densidad de anticuerpo inmovilizado.Publicación Acceso Abierto Phenotypic and genetic analyses of 111 clinical and environmental O1, O139, and non-O1/O139 Vibrio cholerae strains from different geographical areas(Cambridge University Press, 2012-08-05) Sellek Cano, Ricela; Niemcewicz, Marcin; Olsen, Jaran; Bassy Alvarez, Olga; Lorenzo Lozano, Paloma; Martí, L.; Roszowiak, A.; Kocik, J.; Cabria Ramos, Juan CarlosA total of 111 clinical and environmental O1, O139 and non-O1/O139 Vibrio cholerae strains isolated between 1978 and 2008 from different geographical areas were typed using a combination of methods: antibiotic susceptibility, biochemical test, serogroup, serotype, biotype, sequences containing variable numbers of tandem repeats (VNTRs) and virulence genes ctxA and tcpA amplification. As a result of the performed typing work, the strains were organized into four clusters: cluster A1 included clinical O1 Ogawa and O139 serogroup strains (ctxA + and tcpA +); cluster A2 included clinical non-O1/O139 strains (ctxA − and tcpA −), as well as environmental O1 Inaba and non-O1/O139 strains (ctxA − and tcpA −/tcpA +); cluster B1 contained two clinical O1 strains and environmental non-O1/O139 strains (ctxA − and tcpA +/tcpA −); cluster B2 contained clinical O1 Inaba and Ogawa strains (ctxA + and tcpA +). The results of this work illustrate the advantage of combining several typing methods to discriminate between clinical and environmental V. cholerae strains.Publicación Acceso Abierto Phylogenetic Placement of Isolates Within the Trans-Eurasian Clade A.Br.008/009 of Bacillus anthracis(Multidisciplinary Digital Publishing Institute (MDPI), 2019-12-12) Antwerpen, M.; Beyer, W.; Bassy Alvarez, Olga; Ortega García, María Victoria; Cabria Ramos, Juan Carlos; Grass, G.; Wölfel, R.; Ortega García, M. V. [0000-0002-6948-9591]; Beyer, W. [0000-0002-6376-4230]; Unidad de Excelencia Científica María de Maeztu Centro de Astrobiología del Instituto Nacional de Técnica Aeroespacial y CSIC, MDM-2017-0737The largest phylogenetic lineage known to date of the anthrax pathogen Bacillus anthracis is the wide-spread, so-called Trans-Eurasian clade systematically categorized as the A.Br.008/009 group sharing two defining canonical single-nucleotide polymorphisms (canSNP). In this study, we genome-sequenced a collection of 35 B. anthracis strains of this clade, derived from human infections, animal outbreaks or soil, mostly from European countries isolated between 1936 and 2008. The new data were subjected to comparative chromosomal analysis, together with 75 B. anthracis genomes available in public databases, and the relative placements of these isolates were determined within the global phylogeny of the A.Br.008/009 canSNP group. From this analysis, we have detected 3754 chromosomal SNPs, allowing the assignation of the new chromosomal sequences to established sub-clades, to define new sub-clades, such as two new Spanish, one Bulgarian or one German group(s), or to introduce orphan lineages. SNP-based results were compared with that of a multilocus variable number of tandem repeat analysis (MLVA). This analysis indicated that MLVA typing might provide additional information in cases when genomics yields identical genotypes or shows only minor differences. Introducing the delayed mismatch amplification assay (DMAA) PCR-analysis, we developed a cost-effective method to interrogate for a set of ten phylogenetically informative SNPs within genomes of A.Br.008/009 canSNP clade strains of B. anthracis. By this approach, additional 32 strains could be assigned to five of ten defined clades. View Full-TextPublicación Restringido Rapid identification of Bacillus anthracis by real-time PCR with dual hybridization probes in environmental swabs(Elsevier, 2017-11-04) Bassy Alvarez, Olga; Jiménez, Oscar; Ortega García, María Victoria; Granja, Carmen; Cabria Ramos, Juan CarlosIn the present study, we report the development of a real-time PCR assay for the identification of Bacillus anthracis, based on the amplification of a unique chromosomal marker, the E4 sequence, with dual hybridization probes. The assay was evaluated using a panel of ten B. anthracis strains, two B. anthracis isolates from human clinical samples, 12 B. anthracis environmental swabs and 40 non- B. anthracis strains. All 12 B. anthracis strains and clinical isolates were correctly detected, and the method did not show cross-reactions with other micro-organisms. Likewise, the E4 sequence was not found in those strains of B. thuringiensis and B. cereus closely related (homology > 90%) to B. anthracis by computer analysis. On the other hand, this molecular assay showed a high analytical sensitivity, 3.5 genome equivalents per reaction at 95% probability. Furthermore, the real-time PCR assay allowed sequence-specific detection of the amplicon (melting peak with a Tm of 63.5 °C ± 0.5 °C) without post-amplification procedures, which offers an additional advantage over other qPCR assays for B. anthracis detection. Finally, the performance of the method was successfully evaluated in 12 environmental samples. In summary, we have developed a rapid and specific method for the molecular identification of Bacillus anthracis in environmental samples.
